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    本發明揭示一種抗5T4抗體-藥物共軛體及製備和使用彼等之方法。
    公开号:TW201302795A
    申请号:TW101110867
    申请日:2012-03-28
    公开日:2013-01-16
    发明作者:John Francis Dijoseph；Hans-Peter Gerber；Kiran Manohar Khandke；Kimberly Ann Marquette；Puja Sapra；Lioudmila Gennadievna Tchistiakova
    申请人:Wyeth Llc；
    IPC主号:A61K47-00
    专利说明:
    抗體-藥物共軛體
    本發明大抵關於用於治療癌之抗5T4抗體-藥物共軛體。
    抗體-藥物共軛體(ADC)兼具單株抗體之結合特異性及化學治療劑之效力。與發展抗腫瘤相關性標靶分子之單株抗體有關之技術、更有效之細胞毒性劑之用途及共價結合這些成份之化學連接子的設計，在近年來已快速進展(Ducry L.,et al.Bioconjugate Chemistry,21：5-13,2010)。
    極具潛力之ADC諸如SGN-75(US2009/148942)和曲妥珠單抗(trastuzumab)-DM1(US2009/0226465)目前正進行臨床試驗。然而，因考慮以其他腫瘤相關性抗原作為標靶，仍存在許多挑戰。各種單株抗體必須被分別特徵化並設計適當之連接子，並且識別在遞送至腫瘤細胞時仍保留彼之效力之適當細胞毒性劑。必須考慮癌標靶上之抗原密度，及正常組織是否表現該標靶抗原。其他考量包括當與標靶結合時該整個ADC是否被內化、考慮可能的正常組織暴露及/或欲治療之癌類型及分期時以選用細胞靜止劑或細胞毒性劑為較佳、及連接該抗體與該載荷藥物之連接子係可被切割或不可切割之鍵結。另外，該抗體對藥物基團之共軛比必須足夠，且不損害該抗體之結合活性及/或該藥物之效力。很明顯地，ADC係複雜之生物製劑，且發展有效ADC之挑戰仍然很高。
    人5T4腫瘤相關性抗原係本發明之標靶抗原。最近已有資料顯示，該5T4抗原係以高量表現於某些高成瘤性細胞上，這些高成瘤性細胞亦稱為引發腫瘤細胞(WO2010/111659)。引發腫瘤細胞顯示對標準療法之抗藥性，其被認為是造成腫瘤復發及轉移的原因，因此代表另一種ADC發展之障礙。
    本發明之新穎的抗5T4 ADC克服該些與ADC技術相關之挑戰，提供能與表現5T4抗原之腫瘤細胞結合且遞送足夠細胞毒性藥物至該等細胞之高特異性及強效之ADC，因此提供創新且有效之癌治療。 發明前述
    在一實施態樣中，本發明之抗體-藥物共軛體具有下式：Ab-(LU-D)p或彼之醫藥上可接受之鹽，其中Ab係抗5T4抗體或彼之抗原結合部位，該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位包含具有如SEQ ID NO：5所示之VH CDR1區、如SEQ ID NO：6所示之VH CDR2區及如SEQ ID NO：7所示之VH CDR3區之重鏈可變區，LU係選自順丁烯二醯亞胺基己醯基或順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸(Val)-瓜胺酸(Cit)-PABA之連接子單位，p係自約1至約8之整數，且D係選自MMAE、MMAF或MMAD之藥物單位。
    本發明另提供抗5T4抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位包含具有(a)如SEQ ID NO：5所示之VH CDR1區、(b)如SEQ ID NO：6所示之VH CDR2區、及(c)如SEQ ID NO：7所示之VH CDR3區之重鏈可變區。
    本發明另提供抗5T4抗體-藥物共軛體，其中該抗ST4抗體或彼之抗原結合部位包含具有(a)如SEQ ID NO：8所示之VL CDR1區、(b)如SEQ ID NO：9所示之VL CDR2區、及(c)如SEQ ID NO：10所示之VL CDR3區之輕鏈可變區。
    本發明另提供抗5T4抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位另包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區具有(a)如SEQ ID NO：5所示之VH CDR1區、(b)如SEQ ID NO：6所示之VH CDR2區、及(c)如SEQ ID NO：7所示之VH CDR3區，且該輕鏈可變區具有(a)如SEQ ID NO：8所示之VL CDR1區、(b)如SEQ ID NO：9所示之VL CDR2區、及(c)如SEQ ID NO：10所示之VL CDR3區。
    本發明另提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位包含SEQ ID NO：3之VH區及SEQ ID NO：4之VL區。
    本發明另提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體係由具有SEQ ID NO：1之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成。
    本發明另提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中：(a)該抗5T4抗體係由具有SEQ ID NO：1之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成、(b)該LU係順丁烯二醯亞胺基己醯基、(c)該藥物係MMAF、及(d)p係大約4之整數。
    本發明另提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中：(a)該抗ST4抗體係由具有SEQ ID NO：1之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成、(b)該LU係順丁烯二醯亞胺基己醯基-Val-Cit-PABA、(c)該藥物係MMAE、及(d)p係大約4之整數。
    本發明另提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中(a)該抗5T4抗體係由具有SEQ ID NO：1之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成、(b)該LU係順丁烯二醯亞胺基己醯基-Val-Cit-PABA、(c)該藥物係MMAD、及(d)p係自約1至約8之整數。
    本發明另提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中：(a)該抗5T4抗體係由具有SEQ ID NO：15之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成、(b)該LU係順丁烯二醯亞胺基己醯基-Val-Cit-PABA、(c)該藥物係MMAE、及(d)p係自約1至約8之整數。
    本發明提供一種抗5T4抗體-藥物共軛體，其中該抗體辨識人5T4抗原上之表位，其中該表位包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的胺基酸殘基173至258及282至361。
    本發明提供一種醫藥組成物，其包含上述之抗體-藥物共軛體及醫藥上可接受之載劑。
    本發明另提供一種治療有需要治療之病患的5T4陽性癌之方法，該方法包含對該病患投予上述之抗體-藥物共軛體。
    本發明另提供一種治療5T4陽性癌之方法，其中該癌係選自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、皮膚癌、胃癌或睪丸癌。
    更佳地，本發明提供一種治療5T4陽性癌之方法，其中該癌係選自結直腸癌、乳癌、胰癌或非小細胞肺癌。
    本發明另提供一種用於治療之上述之抗體-藥物共軛體。
    本發明另提供一種上述之抗體-藥物共軛體於製造藥物之用途。
    本發明另提供上述之用途，其中該用途係治療5T4陽性癌且其中該癌係選自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、皮膚癌、胃癌或睪丸癌。
    更佳地，本發明另提供上述之用途，其中該用途係治療5T4陽性癌且其中該癌係選自結直腸癌、乳癌、胰癌或非小細胞肺癌。
    本發明另提供編碼抗5T4抗體之核酸、包含該核酸之載體及包含該載體之宿主細胞。
    本發明另提供一種產製抗5T4抗體之方法，該方法包含培養包含該上述之載體之宿主細胞及自該細胞培養回收該抗體。
    本發明另提供一種產製抗5T4抗體-藥物共軛體之方法，該方法包含：(a)取得自該細胞培養回收之抗體，(b)使該抗體經由選自順丁烯二醯亞胺基己醯基或順丁烯二醯亞胺基己醯基-Val-Cit之連接子單位與選自MMAE、MMAD或MMAF之藥物單位化學連接，及(c)純化該抗體-藥物共軛體。 本發明之詳細說明
    本發明提供用於治療癌之抗5T4抗體-藥物共軛體。為了更清楚地瞭解本發明，首先定義一些用語。
    本揭示內容中使用之所有胺基酸縮寫係該些於37 C.F.R.§ 1.822(B)(I)闡述之美國專利商標局接受之縮寫。
    5T4係指5T4腫瘤胎兒抗原，其為72 kDa之高度糖基化的跨膜糖蛋白，該跨膜糖蛋白包含42 kDa之非糖基化核心(見US 5,869,053)。人5T4係表現於多種癌類型，包括膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、皮膚癌、胃癌及睪丸癌。高成瘤性細胞又稱為癌幹細胞或引發腫瘤細胞已經顯示具有高量之5T4表現(WO2010/111659)。本發明之抗5T4抗體包括與該人5T4抗原特異性結合之抗體(見US 2007/0231333)。
    「抗體」係免疫球蛋白分子，其可透過位於該免疫球蛋白分子之可變區的至少一個抗原辨認區特異性地與目標結合，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此處所使用之「抗體」不僅包含完整之多株或單株抗體，亦包含彼等之任何抗原結合片段(即「抗原結合部位」)或單鏈、包含抗體之融合蛋白及包含抗原辨認區之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之構型，包括例如但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、由VH和CH1結構域組成之Fd片段、由抗體之單臂的VL和VH結構域組成之Fv片段、經分離之互補決定區(CDR)、scFv、單結構域抗體(例如鯊魚及駱駝抗體)、大型抗體(maxibodies)、迷你抗體(minibodies)、細胞內抗體(intrabodies)、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及bis-scFv。
    抗體包括任何類型之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或彼等之亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。根據彼之重鏈的恆定區之抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同類型。有五種主要的免疫球蛋白類型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些類型可進一步分成亞型(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定區分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型係廣為週知。
    抗體之「可變區」係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(不論單獨或組合)。如該領域所知，重鏈及輕鏈之可變區各由四個架構區(FR)及連接該四個架構區之三個互補決定區(CDR)(亦稱為超變異區)組成，以形成該抗體之抗原結合部位。若主體可變區之變異體係為所欲，特別是具有CDR區以外(即架構區)之胺基酸殘基取代，適當之胺基酸取代(較佳地保守性胺基酸取代)可藉由比較該主體可變區與其他包含和該主體可變區相同之典範類型(canonical class)的CDR1及CDR2序列之抗體的可變區加以識別(Chothia and Lesk,J Mol Biol 196(4)：901-917,1987)。當選擇FR以於旁側連接主體CDR時，例如當人化或最佳化抗體時，源自包含該相同典範類型之CDR1及CDR2序列的抗體之FR係較佳。
    可變結構域之「CDR」係位於可變區內之胺基酸殘基，其係根據卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、卡巴及柯西亞二者之累積定義、AbM定義、接觸定義、及/或構形定義、或該領域廣為周知之任何CDR測定方法加以識別。抗體CDR可能被識別為原本由卡巴等人所定義之超變異區。見例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington,D.C.。該等CDR之位置亦可能被識別為最初由柯西亞等人所描述之結構環狀結構。見例如Chothia et al.,1989,Nature 342：877-883。其他其他識別CDR之方法包括「AbM定義」(其係卡巴法及柯西亞法之折衷，源自利用牛津分子(Oxford Molecular)之AbM抗體模式軟體(現為Accelrys®))，或如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262：732-745所述以觀察到之抗原接觸為基礎之CDR的「接觸定義」。在此處稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可能被鑑別為對抗原結合造成焓貢獻之殘基。見例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。其他CDR邊界定義可能不嚴格遵守上述方法中之一者，但將與至少部分之卡巴CDR重疊，雖然它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用之CDR可能指由該領域已知之任何方法(包括多種方法之組合)所定義之CDR。此處所使用之方法可利用根據這些方法中任一者所定義之CDR。以包含超過一種CDR之任何給定實施態樣而言，該CDR可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
    用語「單株抗體」(Mab)係指源自單一細胞或細胞株之抗體，包括例如任何真核、原核或噬菌體株，並不是指彼之產製方法。較佳地，本發明之單株抗體存在於均質或實質上均質之族群。
    「人化」抗體係指非人(例如鼠)抗體之形式，其為包含源自非人免疫球蛋白之最少序列之嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或彼等之片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2)或抗體之其他抗原結合子序列)。較佳地，人化抗體係其中源自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被源自諸如具有該所欲特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔等非人物種(捐贈者抗體)之CDR的殘基所取代之人免疫球蛋白(接受者抗體)。
    用語「嵌合抗體」係用來指其中該可變區序列係源自一物種且該恆定區序列係源自另一物種之抗體，諸如其中該可變區序列係源自小鼠抗體且該恆定區序列係源自人抗體之抗體。
    本發明之抗體可利用該領域廣為周知之技術製備，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術之組合、或該領域已知之其他技術(見例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50(1999)及Fellouse,F.A.,et al,J.Mol.Biol.,373(4)：924-40(2007))。
    下表1及2說明用於本發明之抗體之較佳CDR。

    本發明包括一種抗體或彼之抗原結合部位，該抗體或彼之抗原結合部位包含：a)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：i)具有選自SEQ ID NO：8或17之胺基酸序列的LCDR1，ii)具有選自SEQ ID NO：9或18之胺基酸序列的LCDR2，及iii)具有選自SEQ ID NO：10或19之胺基酸序列的LCDR3，和b)重鏈可變區，該重鏈可變區包含：i)具有選自SEQ ID NO：5或22之胺基酸序列的HCDR1，ii)具有選自SEQ ID NO：6或23之胺基酸序列的HCDR2，及iii)具有選自SEQ ID NO：7或24之胺基酸序列的HCDR3。
    本發明之較佳抗體或彼之抗原結合部位包含：a)LCVR，其包含SEQ ID NO：8之LCDR1、SEQ ID NO：9之LCDR2及SEQ ID NO：10之LCDR3，及b)HCVR，其包含SEQ ID NO：5之HCDR1、SEQ ID NO：6之HCDR2及SEQ ID NO：7之HCDR3。
    本發明之較佳單株抗體在此處被稱為A1(人化抗5T4 IgG1抗體)、A1-IgG4(人化抗5T4 IgG4抗體)、A3(小鼠/人嵌合抗體)、及A3hu(人化抗5T4 IgG1抗體)。編碼單株抗體A1、A1-IgG4及A3之胺基酸序列的SEQ ID NO係提供於下表3：
    用語「辨識抗原之抗體」及「對抗原具特異性之抗體」在此處可與用語「與抗原特異性結合之抗體」互相交換使用。
    抗5T4抗體-藥物共軛體係指抗5T4抗體或彼之抗原結合部位如此處所述之經由連接子單位分子(LU)與細胞毒性藥物基團(D)連接。
    連接子單位(LU)：LU描述該抗體與該藥物間之直接或間接鍵結。將連接子連接至mAb可經由許多方式完成，諸如經由表面離胺酸、還原偶合至經氧化之碳水化合物、及經由還原鏈間雙硫鍵所釋放之半胱胺酸殘基。多種ADC鍵接系統係該領域所知，包括以腙、雙硫及肽為基底之鍵接。
    藥物(D)：藥物係具有生物性或可偵測之活性之任何物質(例如治療劑、可偵測之標記、結合劑等)及在活體內被代謝成活性劑之前藥。用語「藥物」及「載荷藥物」可互相交換使用。在一些實施態樣中，該藥物係耳抑素(auristatin)，諸如耳抑素E(該領域亦稱之為海兔毒素(dolastatin)-10之衍生物)或彼之衍生物。該耳抑素可為例如由耳抑素E和酮酸形成之酯。舉例來說，耳抑素E可與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應以分別產生AEB及AEVB。其他典型耳抑素包括AFP、MMAF及MMAE。示範性耳抑素之合成及結構係描述於美國專利第6,884,869、7,098,308、7,256,257、7,423,116、7,498,298及7,745,394號，各以參照方式整體納入此處以符合所有目的。
    耳抑素已經顯示可干擾微管動力學及核分裂和細胞分裂，且具有抗癌活性。本發明之耳抑素與微管蛋白結合，並展示對5T4表現細胞或細胞系之細胞毒性或細胞靜止效應。有一些該領域已知之不同的檢測方法可被用於測定耳抑素或其形成之抗體-藥物共軛體是否對所欲之細胞或細胞系展現細胞靜止或細胞毒性效應。測定化合物是否與微管蛋白結合之方法係該領域所知。見例如Muller et al.,Anal.Chem 2006,78,4390-4397、Hamel et al.,Molecular Pharmacology,1995 47：965-976、及Hamel et al.,The Journal of Biological Chemistry,1990 265：28,17141-17149。
    藥物或載荷藥物之實例係選自DM1(美坦素(maytansine)、N2'-去乙醯基-N2'-(3-氫硫基-1-側氧基丙基)-或N2'-去乙醯基-N2'-(3-氫硫基-1-側氧基丙基)-美坦素)、mc-MMAD(6-順丁烯二醯亞胺基己醯基-一甲基耳抑素-D或N-甲基-L-異纈胺醯基-N-[(1S,2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]胺基]丙基]-1-吡咯啶基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基]-N-甲基-(9Cl)-L-纈胺醯胺)、mc-MMAF(順丁烯二醯亞胺基己醯基-一甲基耳抑素F或N-[6-(2,5-二氫-2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)-1-側氧基己基]-N-甲基-L-異纈胺醯基-L-異纈胺醯基-(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基胺基)庚醯基-(αR,βR,2S)-β-甲氧基-α-甲基-2-吡咯啶基丙醯基-L-苯丙胺酸)、或mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-順丁烯二醯亞胺基己醯基-ValcCit-(p-胺基苯甲氧基羰基)-一甲基耳抑素E或N-[[[4-[[N-[6-(2,5-二氫-2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)-1-側氧基己基]-L-異纈胺醯基-N5-(胺基羰基)-L-鳥胺醯基]胺基]苯基]甲氧基]羰基]-N-甲基-L-異纈胺醯基-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羥基-1-甲基-2-苯基乙基]胺基]-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]-1-吡咯啶基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。DM1係微管蛋白抑制劑美坦素之衍生物，而MMAD、MMAE及MMAF係耳抑素衍生物。本發明之較佳的載荷藥物係選自mc-MMAF或mc-Val-Cit-PABA-MMAE。
    用語「表位」係指能被抗體之一或多個抗原結合區所辨認及結合之分子的部位。表位通常係由分子之化學活性表面基團組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。此處使用之用語「抗原性表位」係定義為多肽之一部分，該部分藉由該領域廣為周知之任何方法(例如習用之免疫測定法)測定可被抗體專一性結合。「非線性表位」或「構型表位」包含在抗原性蛋白質內之不連續多肽(或胺基酸)，該不連續多肽(或胺基酸)被對該表位具專一性之抗體所結合。
    此處所使用之用語「結合親和性(KD)」係意圖指稱特定抗原-抗體交互作用之解離常數。KD係解離速率(亦稱"off-rate (koff)")對結合速率(或稱"on-rate(kon)")之比。因此，KD等於koff/kon，並以莫耳濃度(M)表示。由此可知當KD越小時，該結合之親和性越強。因此，KD等於1 μM表示相較於KD等於1 nM具有微弱之結合親和性。抗體之KD值可利用該領域完整建立之方法測定。一種用於測定抗體之KD之方法係利用表面電漿共振(SPR)，通常使用諸如Biacore®系統之生物感測器系統。
    此處所使用之用語「特異性結合」關於抗體與5T4抗原之間的結合且在25℃以SPR測定時該抗體以小於約30 nM之KD與該5T4抗原結合。
    此處所使用之醫藥上可接受之鹽係指分子或巨分子之醫藥上可接受之有機或無機鹽。
    用語「效力」係生物活性之測量值，可以IC50表示，或如實施例3所描述之抑制50%之5T4陽性細胞系生長所需之抗體的有效濃度。或者，效力可能指如實施例4所示之活體內腫瘤異種移植模式中測定之抗腫瘤活性。
    此處所使用之用語「多核苷酸」或「核酸分子」係意圖包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但較佳係雙股DNA。
    編碼本發明之抗體之多核苷酸可能包括下列：僅該變異體之編碼序列、該變異體之編碼序列及額外之編碼序列諸如功能性多肽或信號或分泌性序列或原蛋白質序列、該抗體之編碼序列及非編碼序列諸如該抗體之編碼序列的內含子或5’及/或3’非編碼序列。用語「編碼抗體之多核苷酸」包含包括額外之變異體的編碼序列之多核苷酸，但亦包含包括額外之編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。該領域已知的是，對於特定宿主細胞/表現系統而言最佳化之多核苷酸序列可輕易地得自該所欲蛋白質之胺基酸序列(見GENEART® AG，德國雷根斯堡(Regensburg,Germany))。
    編碼本發明之抗體之多核苷酸通常將包括與該抗體編碼序列可操作性連接之表現控制多核苷酸序列，包括該領域已知之天然相關性或異源性啟動子區域。較佳地，該表現控制序列將為能轉形或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子系統，但用於原核宿主之控制序列亦可被使用。一旦該載體被納入適當宿主細胞系之後，該宿主細胞在適合表現該核苷酸序列之條件下增殖，及如所欲，收集及純化該抗體。較佳之真核細胞系包括CHO細胞系、各種COS細胞系、海拉(HeLa)細胞、骨髓瘤細胞系、經轉形之B細胞、或人胚胎腎細胞系。最佳之宿主細胞係CHO細胞系。
    本發明包含與5T4抗原上之特定表位結合之抗體或彼等之抗原結合部位。該經識別之表位係非線性或構型表位，其包含在人5T4抗原(SEQ ID NO：11)之胺基酸殘基173與252之間的第一接觸及包含在胺基酸殘基276與355之間的第二接觸(見實施例7)。因此，此處所描述之CDR及重鏈和輕鏈之可變區被用來製備全長抗體以及功能性片段及類似物，以維持該採用對5T4抗原之上述表位具特異性之CDR的蛋白質之結合親和性。
    本發明之抗體的結合親和性係利用SPR測定(實施例6)。在這些試驗中，該5T4抗原係以低密度固定於BIAcore®晶片上，抗體則流經該晶片。在晶片表面上累積之物質係經測量。此分析方法允許即時測定結合速率及解離速率二者以獲得結合之親和性(KD)。本發明之人化抗體具有介於約0.30至約30 nM、約0.30至約20 nM、約0.30至約10 nM、約0.5至約7 nM、約1.0至約5 nM、及約1.0至約3 nM之KD。 藥物與抗體之共軛
    該藥物已經或係經修飾以包括與該抗體上之共軛點具反應性之基團。舉例來說，藥物可藉由烷化(例如該抗體之ε-胺基離胺酸或N端)、還原胺化經氧化之碳水化合物、羥基與羧基之間轉酯化、醯胺化胺基或羧基及與硫醇共軛加以連接。在一些實施態樣中，與每個抗體分子共軛之藥物基團的數目p介於1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2之平均值。在一些實施態樣中，p介於2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、或2至3之平均值。在其他實施態樣中，p係1、2、3、4、5、6、7或8之平均值。在一些實施態樣中，p介於約1至約8、約1至約7、約1至約6、約1至約5、約1至約4、約1至約3、或約1至約2之平均值。在一些實施態樣中，p介於約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4、或約2至約3。以可被用於共軛之化學為例，見例如Current Protocols in Protein Science(John Wiley & Sons,Inc.)，第15章(蛋白質之化學修飾)(該文獻之揭示內容以參照方式整體納入此處)。
    舉例來說，當以化學活化蛋白質導致形成游離硫醇基團時，該蛋白質可能利用氫硫基反應劑共軛。在一態樣中，該劑係實質上對游離硫醇基具特異性之劑。該等劑包括例如順丁烯二醯亞胺、鹵代乙醯胺(例如碘代乙醯胺、溴代乙醯胺或氯代乙醯胺)、鹵代酯(例如碘代酯、溴代酯或氯代酯)、鹵代甲基酮(例如碘代甲基酮、溴代甲基酮或氯代甲基酮)、鹵化苄(例如碘化苄、溴化苄或氯化苄)、乙烯碸及吡啶基硫。 連接子
    該藥物可藉由連接子與抗體連接。適當之連接子包括例如可切割及不可切割之連接子。可切割之連接子在細胞內之條件下通常易受切割。適當之可切割性連接子包括例如可被細胞內蛋白酶(諸如溶酶體蛋白酶或核內體蛋白酶)切割之肽連接子。在示範性實施態樣中，該連接子可為雙肽連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、苯丙胺酸-離胺酸(phe-lys)連接子或順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苯甲氧基羰基(mc-Val-Cit-PABA)連接子。另一連接子係磺基琥珀醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺基-smcc共軛經由順丁烯二醯亞胺基發生，該順丁烯二醯亞胺基與氫硫基(硫醇基，-SH)反應，同時彼之磺基-NHS酯係對一級胺有反應性(如在離胺酸及該蛋白質或肽N端中可見)。還有另一種連接子係順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。其他適當之連接子包括可在特定pH或pH範圍內被水解之連接子，諸如腙連接子。其他適當之可切割性連接子包括二硫化物連接子。該連接子可與該抗體共價連接，該共價連接之程度使得該抗體必須在細胞內被降解才能讓該藥物被釋放，例如mc連接子及該類似物。
    連接子可包括用於與該抗體鍵接之基團。舉例來說，連接子可包括胺基、羥基、羧基或氫硫基反應基團(例如順丁烯二醯亞胺、鹵代乙醯胺(例如碘代乙醯胺、溴代乙醯胺或氯代乙醯胺)、鹵代酯(例如碘代酯、溴代酯或氯代酯)、鹵代甲基酮(例如碘代甲基酮、溴代甲基酮或氯代甲基酮)、鹵化苄(例如碘化苄、溴化苄或氯化苄)、乙烯碸及吡啶基硫)。一般可見Wong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking；CRC Press,Inc.,Boca Raton,1991。 免疫療法
    就免疫療法而言，抗體可與適當之藥物共軛，諸如細胞毒性劑、細胞靜止劑、免疫抑制劑、放射性同位素、毒素或該類似物。該共軛體可被用於抑制腫瘤細胞或癌細胞之增生、造成腫瘤細胞或癌細胞之細胞凋亡、或用於治療病患之癌。該共軛體可據此被用於不同條件以治療動物癌症。該共軛體可被用於遞送藥物至腫瘤細胞或癌細胞。在不受理論束縛之前提下，在一些實施態樣中，該共軛體與癌細胞或腫瘤相關抗原結合或相連，且該共軛體及/或藥物可經由受體媒介性胞飲作用進入腫瘤細胞或癌細胞內。該抗原可附著於腫瘤細胞或癌細胞，或可為與該腫瘤細胞或癌細胞相連之細胞外基質蛋白質。一旦進入細胞內，該共軛體內(例如在連接子中)之一或多種特定肽序列被一或多種腫瘤細胞或癌細胞相關性蛋白酶水解切割，導致釋放該藥物。該經釋放之藥物接著可自由在細胞內移動以誘導細胞毒性或細胞靜止或其他活性。在一些實施態樣中，該藥物係在腫瘤細胞或癌細胞之外與該抗體切割，該藥物接著進入該細胞內或作用在該細胞表面。 癌治療
    如上所述，癌(包括但不限於腫瘤、轉移或其他以不受控制之細胞生長為特徵之疾病或病狀)可藉由投予蛋白質-藥物共軛體加以治療或預防。
    在其他實施態樣中，本發明提供治療或預防癌之方法，包括對有需要治療或預防癌之病患投予有效量之共軛體及化學治療劑。在一些實施態樣中，該化學治療劑係指以其治療癌尚未發現有不反應性之劑。在一些實施態樣中，該化學治療劑係指以其治療癌已發現有不反應性之劑。該共軛體可被投予至亦接受治療(諸如用於治療癌之手術)之病患。在另一實施態樣中，該額外之治療方法係放射療法。 癌之多藥物療法
    治療癌之方法包括對有需要治療之病患投予有效量之抗體-藥物共軛體及另一種係抗癌劑之治療劑。適當之抗癌劑包括但不限於甲胺喋呤(methotrexate)、紫杉醇(taxol)、L-天冬醯胺酶、巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤、羥基脲、阿糖胞苷(cytarabine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷酸胺(ifosfamide)、亞硝基尿素、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、絲裂黴素、氮烯唑胺(dacarbazine)、甲基苄肼(procarbizine)、拓撲替康(topotecan)、氮芥子氣、環磷醯胺(cytoxan)、依扥泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、BCNU、伊立替康(irinotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、博來黴素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、正定黴素(daunorubicin)、達克黴素(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、雙羥葱醌(mitoxantrone)、天冬醯胺酶、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春瑞濱(vinorelbine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、卡利奇黴素(calicheamicin)及多西紫杉醇(docetaxel)。
    本發明之ADC可為供投予之醫藥組成物之形式，其係經調製成適用於經選擇之投予模式，及醫藥上可接受之稀釋劑或賦形劑，諸如緩衝劑、界面活性劑、保存劑、助溶劑、等滲劑、穩定劑、載劑及該類似物。以參照方式納入此處之Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton Pa.,18th ed.,1995提供該領域通常熟知之調製技術的概要。
    這些醫藥組成物可藉由該領域已知之可達成治療癌之一般性目的之任何方法投予。較佳之投予途徑係非口服，在此處定義為包括但不限於靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下及關節內注射及灌注之投予模式。經投予之劑量將視接受者之年齡、健康及體重、併用治療之種類(若有的話)、治療頻率、及所欲效應之性質而定。
    在本發明之範圍內的組成物包括其中ADC係以能有效達成治療癌之所欲醫學效應的量存在之所有組成物。雖然個體需求可能因每位病患而異，決定該等所有成份之有效量的理想範圍係具有一般技藝之臨床醫師之能力範圍之內。 實施例1 抗5T4 ADC之製備
    5T4-A1抗體藥物共軛體(ADC)之製備係藉由三(2-羧基乙基)膦(TCEP)部分還原該mAb，接著由經還原之Cys殘基與該所欲之順丁烯二醯亞胺端連接子-載荷藥物反應。特別是，5T4-A1 mAb係藉由添加於100 mM HEPES(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩衝液)pH 7.0中之2.8莫耳過量之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)及1 mM二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)於37℃部分還原2小時。該所欲之連接子-載荷藥物接著被添加至該反應混合物，該連接子-載荷藥物/mAb-硫醇之莫耳比係5.5(順丁烯二醯亞胺基己醯基-一甲基耳抑素F[mc-MMAF])或8(順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苯甲氧基羰基-一甲基耳抑素E[mc-Val-Cit-PABA-MMAE])，在15%體積比之二甲基乙醯胺(DMA)存在時於25℃再反應1小時。經1小時之培養期後，添加N-乙基順丁烯二醯亞胺(為mc-MMAF之4.5倍過量及mc-Val-Cit-PABA-MMAE之2倍過量)以加蓋未反應之硫醇基，允許反應15分鐘，接著添加6倍過量之L-Cys以淬熄任何未反應之連接子-載荷藥物。該反應混合物係於磷酸緩衝鹽水(PBS)pH 7.4、4℃中隔夜透析，並經由SEC(AKTA explorer蛋白質純化儀，Superdex 200 10/30 GL管柱)純化。該ADC接著利用大小排除層析(SEC)分析純度，以疏水交互作用層析(HIC)及液體層析電噴灑離子化串聯質譜儀(LC-ESI MS)計算載荷量，並經由UV分光光度計測定濃度。 實施例2 結合性試驗
    表現5T4抗原之細胞及陰性對照拉許(Raji)細胞係以密度500,000細胞/孔被接種至非組織培養處理之96孔盤並保存於冰上。A1及A1-IgG4抗體或A1-mcMMAF ADC之稀釋液係以3%牛血清白蛋白BSA於達爾柏克(Dulbecco)氏磷酸緩衝鹽水(DPBS)中製備，並添加至該盤上使終濃度成為10μg/mL。該等孔盤接著於冰上培養1小時，然後清洗2次。二級抗體(與PE(藻紅素)共軛之山羊抗人IgG Fc)係經添加至孔槽。在4℃培養30分鐘後，利用流式細胞分析儀測量平均螢光強度。
    表4中之資料顯示該A1抗體與多種5T4陽性細胞系結合。表5之資料顯示A1與A1-IgG4抗體以及A1-mcMMAFADC對多種不同細胞表現類似之結合性。
    實施例3 細胞毒性試驗
    表現5T4之細胞系及陰性對照Raji細胞系係與漸增濃度之ADC一起培養。經過四天後，檢測各培養之存活性。IC50值係藉由邏輯非線性回歸計算並以ng Ab/mL表示。A1-mcMMAF、A1-vcMMAE、A3-mcMMAF及A3-mcMMAE顯示可抑制5T4表現細胞系之生長(MDAMB435/5T4、MDAMB468及MDAMB361DYT2)，但對5T4陰性細胞(Raji)無反應性(表6)。
    此外，5T4+原發性肺腫瘤37622a細胞係經分離及生長於培養中。細胞與漸增濃度之ADC一起培養。十天之後，各培養之存活性係利用MTS方法檢測。IC50值係藉由邏輯非線性回歸計算並以ng Ab/ml表示。A1-mcMMAF、A1-vcMMAE、A3-mcMMAF及A3-vcMMAE抑制原發性肺腫瘤細胞之生長(表7)。
    實施例4 皮下異種移植模式
    無胸腺(裸)母鼠(或另一種免疫抑制小鼠品系)係經皮下注射MDAMB435/5T4、MDAMB361DYT2或H1975腫瘤細胞。具有分期腫瘤大約0.1至0.3克之小鼠(n=6至10隻小鼠/治療組)經靜脈投予Q4Dx4之生理鹽水(載具)、A1-mcMMAF、A1-vcMMAE、A1-mcMMAD、A1-smccDM1、A3-mcMMAF、A3-vcMMAE或與mcMMAF或vcMMAE共軛之非結合性對照抗體，劑量為3 mg Ab/kg。所有ADC皆根據Ab含量投予。每周至少測量一次腫瘤，彼等之大小(mm2±SEM)係由下式計算：mm2=0.5x(腫瘤寬度2)x(腫瘤長度)。
    表8中之資料顯示A1-mcMMAF、A1-vcMMAE、A1-vcMMAD、A3-mcMMAF及A3-vcMMAE抑制MDAMB435/5T4異種移植之生長，然而A1-mcMMAD及A1-smccDM1在此模式中不具活性。
    表9中之資料顯示A1-mcMMAF、A1-vcMMAE、A1-vcMMAD、A1-smccDM1、A3-mcMMAF及A3-vcMMAE抑制MDAMB361DYT2異種移植之生長，然而A1-mcMMAD在此模式中不具活性。
    表10中之資料顯示A1-mcMMAF、A1-vcMMAE、A1-vcMMAD、A3-mcMMAF及A3-vcMMAE抑制H1975異種移植之生長，然而A1-mcMMAD及A1-smccDM1在此模式中不具活性。

    或者，具有皮下建立之37622a原發性腫瘤細胞異種移植之裸鼠係以劑量3 mg Ab/kg之A1-mcMMAF、A1-mcMMAD、A1-vcMMAD或A3-mcMMAF經靜脈注射Q4Dx4治療，腫瘤生長係於96天期間監測。表11顯示相較於載具對照治療之動物，A1-mcMMAF、A1-vcMMAD及A3-mcMMAF抑制37622a原發性腫瘤異種移植之生長，然而A1-mcMMAD在此模式中不具活性。
    不預期地，表8至11中之資料顯示具有相同抗體及載荷藥物但連接子不同之ADC具有不同之療效特性，即所有四個異種移植模式中之A1-mcMMAD與A1-vcMMAD。此外，該資料顯示具有相同抗體及連接子但具有不同載荷藥物之ADC亦具有不同之療效特性，即所有四個異種移植模式中之A1-mcMMAF與A1-mcMMAD。因此，藥物MMAD藉由vc連接子與A1抗體連接時在所有四個異種移植模式中皆有效，但當藉由mc連接子連接時在任一測試之異種移植模式中皆不具活性。相反地，藥物MMAF藉由mc連接子與A1抗體連接時在所有四個異種移植模式中皆高度有效，然而該化學相關之藥物MMAD藉由該相同連接子與該相同之抗體連接時，在所有四個異種移植模式中皆不具活性。
    還有另一項未預期之觀察出現在ADC A1-smccDM1(表8至10)。此ADC對MDAMB361DYT2異種移植非常有效，但對MDAMB435/5T4及H1975異種移植不具實質療效，即使所有異種移植皆高度表現該5T4標靶抗原。此資料顯示該連接子-載荷藥物之療效無法預測，即使利用該相同之高親和性抗體或甚至使用該相同之ADC。 實施例5 抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC) ADCC試驗：
    收集健康志願者之血液至含有肝素鈉之BD Vacutainer CPT細胞製備管。取人週邊血液單核球(PBMC)，將之重懸於檢測緩衝液(RPMI 1640添加10 mM HEPES)成為2.5×107細胞/ml。標靶細胞(MDAMB435/5T4或MDAMB435/neo)係以密度1×104細胞/孔接種於96孔測試盤。添加A1抗體或A1-mcMMAF，接著添加人PBMC效應細胞(5×105)至孔槽中以使效應：標靶細胞比(E：T)為50：1。該檢測盤係於37℃培養4小時以檢測ADCC活性。藉由添加等體積之CytoTox-One試劑(普羅麥加(Promega)公司)以採收該盤。添加停止溶液(Promega；50 ul)至各孔，測量螢光強度以定量乳酸去氫酶之釋放。以陽性對照而言，每孔添加2 μl之溶解緩衝液以於對照孔槽產生最大LDH釋放(100%細胞毒性)。利用下式計算細胞毒性百分比：
    當「實驗性」對應在該等實驗條件中之一者測量之信號，「效應自發性」對應僅PBMC存在時測量之信號，「標靶自發性」對應僅標靶細胞存在時測量之信號，及「標靶最大值」對應僅清潔劑溶解之標靶細胞存在時測量之信號。
    A1-IgG1 Ab及A1-mcMMAF相較於A1-IgG4 Ab之ADCC活性係顯示於表12。該A1抗體及A1-mcMMAF兩者顯示相當之ADCC活性，表示A1-mcMMAF之ADCC活性可能促進彼之抗腫瘤活性。
    實施例6 結合親和性
    表面電漿共振(SPR)分析係利用BIAcore®實施，以測定A1-IgG1及A1-IgG4與人或馬來猴(cynomolgus)5T4於pH 6.0及pH 7.4結合之親和常數。BIAcore®技術利用表面層之折射率在該huA1抗體變異體與固定在該表面層之人5T4蛋白質結合時的變化。結合係藉由SPR偵測，即偵測自表面折射之雷射光。分析信號動力學如結合速率及解離速率能區別非特異性及特異性交互作用。用於此分析之5T4蛋白質係由與人IgG1-Fc結構域融合之人或馬來猴(cynomolgus)5T4胞外域組成，並以低密度(人及馬來猴分別為45.1及45.4 RU)固定於CM5晶片上以正確測量親和常數。
    與該5T4胞外域之特異性結合的測量係藉由減去與參考表面之結合獲得，該參考表面係只有人IgG1-Fc蛋白質以和該5T4-Fc表面上固定之相同密度固定於CM5晶片上。接著，於HBS-EP pH 7.4或MES-EP pH 6.0緩衝液中之不同濃度的A1、A1-IgG4或A3抗體被注射至該表面。該表面在注射週期之間係利用甘胺酸pH 1.7+0.05%界面活性劑P20(GE醫療集團，BR-1000-54)再生二次。
    結果顯示使用低密度5T4表面於pH 6.0及pH 7.4時，A1相較於A1-IgG4具有稍微較高之對人5T4之親和性(分別為1.5倍及1.2倍，表13)。此外，A1於pH 6.0及pH 7.4時皆比A1-IgG4展現稍微較佳之對馬來猴5T4之結合(分別為1.7倍及1.2倍)，且A1及A1-IgG4二者與人5T4之結合皆高於馬來猴5T4之結合3至4倍(表12)。
    比較A1及A3抗體，很明顯地該A1抗體與人及馬來猴5T4之結合在pH 7.4時優於pH 6.0時，然而該A3抗體在pH 6.0時展現相較於pH 7.4時增進之結合(表14)。
    實施例7 利用5T4嵌合物進行表位定位
    為了識別A1及A3抗體結合之表位，利用暫時表現於COS-1細胞中之(1)5T4胞外域Fc建構體及(2)人/小鼠5T4嵌合物建構體實施酶連接免疫吸附測定(ELISA)。該胞外域包括胺基端區域、二個富含白胺酸之重複及介於其間之親水區。小鼠及大鼠5T4胞外域包含在彼等之親水性區域內之6個胺基酸直接重複。
    包含5T4胞外域及源自人IgG1之Fc恆定區的融合蛋白質係利用人5T4(胺基酸1-355)、小鼠5T4(胺基酸1-361)、大鼠5T4(胺基酸1-361)、馬來猴5T4(胺基酸1-355)、黑猩猩5T4(胺基酸1-355)及黑尾狨猴5T4(胺基酸1-355)製備。與人/小鼠5T4嵌合性建構體之結合結果係摘列於表15，其顯示A1及A3抗體之特異性結合、部分結合或缺乏結合。
    表15係指抗體與不同之人/小鼠嵌合體之結合能力，該名稱係由小鼠5T4內容命名。當未觀察到結合時，這表示此為該抗體與人5T4結合之處，因為這些抗體不與小鼠5T4結合。舉例來說，A3抗體具有最多之N端結合表位(介於83-163之間)，結果顯示其與殘基83-163經小鼠5T4取代之5T4嵌合體缺乏結合，因此A3無法與之結合。根據這些結果，可以得知人化A1抗體與人5T4在胺基酸殘基173及252之間具有第一接觸，與人5T4在胺基酸殘基276及355之間具有第二接觸。該A3抗體與人5T4之介於胺基酸殘基83至163之間的第一富含白胺酸重複區結合。該胺基酸殘基之數目對應SEQ ID NO：I1之人5T4抗原胺基酸序列。
    實施例8 比較A1-mcMMAF ADC與A1-IgG4-CM ADC
    比較A1-mcMMAF與A1-IgG4-AcBut卡利奇黴素(calicheamicin)(A1-IGG4-CM)之安全性及療效。A1-4-CM係由A1-IgG4抗體與連接子AcBut[-(4’乙醯基苯氧基)丁酸]共軛至卡利奇黴素載荷藥物組成。卡利奇黴素係一種有效之抗腫瘤劑，其係源自細菌棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)之烯二炔抗生素類。
    A1 Ab、A1-IgG4 Ab、A1-mcMMAF ADC及A1-IgG4-CM ADC之細胞結合活性係利用數種5T4陽性細胞系比較(見實施例2，表5)。資料顯示在A1抗體、A1-IgG4抗體及A1-mcMMAF ADC觀察到類似之結合性，彼等皆對所有測試之5T4陽性細胞系具有相較於A1-IgG4-CM更高之平均螢光強度。
    A1-mcMMAF及A1-IgG4-CM係於MDAMB435/5T4皮下異種移植模式中並行測試。二種ADC皆於腫瘤體積到達大約200 mm2時經靜脈給予(Q4dx2)。劑量3 mg/kg之A1-IgG4-CM的抗腫瘤活性與以10 mg/kg之劑量投予之A1-mcMMAF的抗腫瘤活性類似(表16)。根據這些結果，A1-IgG4-CM之抗腫瘤活性大約高出A1-mcMMAF 3.3倍。
    可預期的是，A1-IgG4-CM相較於A1-mcMMAF高3.3倍之效力可被解讀為A1-mcMMAF在動物毒性試驗中之安全範圍係A1-IgG4-CM之安全範圍的3.3倍。然而，當回顧A1-IgG4-CM於馬來猴(cynomolgus macque)中之安全性時，可得知A1-IgG4-CM在馬來猴中之毒性至少高出A1-mcMMAF 100倍。當A1-IgG4-CM係以0.032、0.095及0.32 mg Ab/kg/週期(2、6、20 μg之卡利奇黴素/kg/週期)投予至公馬來猴(n=3)及母馬來猴(n=3)時，各種劑量皆觀察到毒性。在投予2個週期(2劑)後，0.095治療組之6隻動物中之4隻被安樂死或發現死亡。相反地，在高達10 mg/kg劑量之A1-mcMMAF組(247 μg mcMMAF/kg/週期)，在2次週期(2劑)後之相同的4周期間並未觀察到任何死亡。總結來說，當二者皆投予兩次至馬來猴於4周觀察期間，10 mg/kg劑量組之A1-mcMMAF係安全的，然而0.096 mg/kg劑量組之A1-IgG4-CM被認為具有毒性。
    不預期地，這些結果顯示A1-mcMMAF之安全範圍係A1-IgG4-CM之安全範圍的105倍(10/0.095=105)，而不是根據各ADC之相對抗腫瘤效力所預期之3.3倍安全範圍。此資料顯示利用針對相同抗原標靶之抗體但與不同之載荷藥物共軛之抗體-藥物共軛體具有無法預測之特性。 實施例9 A1-mcMMAF小鼠PK/PD模式及臨床劑量預測
    PK/PD模式已被用於小鼠異種移植試驗以量化A1-mcMMAF之腫瘤反應，以測定對不同細胞系之有效濃度。此處使用之通過區室(transit compartment)腫瘤殺滅PK/PD模式先前係由Simeoni等人描述(Simeoni et al,Cancer Res,64：1094,(2004))。該模式已被改良以應用於腫瘤之線性、指數及S型曲線生長及藥物之飽和殺滅。PK/PD模式參數包括：kg ex 指數生長
    kg S型曲線生長
    w0 最初腫瘤體積
    tau 轉導速率
    kmax 最大殺滅速率
    kC50 一半最大殺滅速率之濃度
    該PK/PD模式結果係用於計算腫瘤靜止濃度(TSC，算式1)。此為當腫瘤生長速率等於腫瘤死亡速率且腫瘤體積維持不變時之藥物濃度。TSC可被定義為療效所需之最小濃度。TSC係用於給予臨床劑量選擇之參考，濃度需大於(>)TSC以求臨床上之療效。
    以A1-mcMMAF而言，小鼠PK係於分開之試驗測定(3mg/kg IV，無胸腺nu/nu母鼠)。小鼠異種移植試驗係利用3種不同之5T4細胞系完成，每四天投予劑量介於1至30 mg/kg之A1-mcMMAF：細胞系MDAMB435/5T4(劑量1、3、10及30 mg/kg)、細胞系H1975(劑量1、3及10 mg/kg)及細胞系37622A(劑量1及10 mg/kg)。PK/PD模式係如下述實施，TSC如表17所示。
    各異種移植細胞系之小鼠PK/PD參數係與A1-mcMMAF之預期人PK結合以模擬達成臨床療效所需之劑量。利用此方法，A1-mcMMAF具有約0.22至約2.3 mg/kg Q3周[每三周]之預期最小有效臨床劑量(表17)。
    在本發明之一實施態樣中，劑量範圍可為每三周投予自約0.18 mg/kg至約2.7 mg/kg、自約0.22 mg/kg至約2.6 mg/kg、自約0.27 mg/kg至約2.5 mg/kg、自約0.32 mg/kg至約2.3 mg/kg、自約0.37 mg/kg至約2.15 mg/kg、自約0.42 mg/kg至約2.10 mg/kg、自約0.47 mg/kg至約2.05 mg/kg、自約0.52 mg/kg至約2.00 mg/kg、自約0.57 mg/kg至約1.95 mg/kg、自約0.62 mg/kg至約1.90 mg/kg、自約0.67 mg/kg至約1.85 mg/kg、自約0.72 mg/kg至約1.80 mg/kg、自約0.82 mg/kg至約1.70 mg/kg、自約0.92 mg/kg至約1.60 mg/kg、自約1.02 mg/kg至約1.50 mg/kg、自約1.12 mg/kg至約1.40 mg/kg、或自約1.20 mg/kg至約1.30 mg/kg。較佳地，劑量範圍可為自約0.22 mg/kg至約2.3 mg/kg。
    序列表
    SEQ ID NO：1人化A1人IgG1重鏈EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNFGMNWVRQAPGKGLEWVAWINTNTGEPRYAEEFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWDGAYFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
    SEQ ID NO：2人化A1人Kappa輕鏈：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYFATNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    SEQ ID NO：3 A1-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNFGMNWVRQAPGKGLEWVAWINTNTGEPRYAEEFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWDGAYFFDYWGQGTLVTVSS
    SEQ ID NO：4 A1-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYFATNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKVEIK
    SEQ ID NO：5 A1-HC CDR1 NFGMN
    SEQ ID NO：6 A1-HC CDR2 WINTNTGEPRYAEEFKG
    SEQ ID NO：7 A1-HC CDR3 DWDGAYFFDY
    SEQ ID NO：8 A1-LC-CDR1 KASQSVSNDVA
    SEQ ID NO：9 A1-LC-CDR2 FATNRYT
    SEQ ID NO：10 A1-LC-CDR3 QQDYSSPWT
    SEQ ID NO：11人5T4抗原MPGGCSRGPAAGDGRLRLARLALVLLGWVSSSSPTSSASSFSSSAPFLASAVSAQPPLPDQCPALCECSEAARTVKCVNRNLTEVPTDLPAYVRNLFLTGNQLAVLPAGAFARRPPLAELAALNLSGSRLDEVRAGAFEHLPSLRQLDLSHNPLADLSPFAFSGSNASVSAPSPLVELILNHIVPPEDERQNRSFEGMVVAALLAGRALQGLRRLELASNHFLYLPRDVLAQLPSLRHLDLSNNSLVSLTYVSFRNLTHLESLHLEDNALKVLHNGTLAELQGLPHIRVFLDNNPWVCDCHMADMVTWLKETEVVQGKDRLTCAYPEKMRNRVLLELNSADLDCDPILPPSLQTSYVFLGIVLALIGAIFLLVLYLNRKGIKKWMHNIRDACRDHMEGYHYRYEINADPRLTNLSSNSDV
    SEQ ID NO：12人化A1人IgG4m重鏈：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNEGMNWVRQAPGKGLEWVAWINTNTGEPRYAEEFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWDGAYFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
    SEQ ID NO：13 A1人IgG4m VH(A1-IGG4-VH)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNFGMNWVRQAPGKGLEWVAWINTNTGEPRYAEEFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWDGAYFFDYWGQGTLVTVSS
    SEQ ID NO：14 A1-IgG4-VH-CDR1 NFGMN
    SEQ ID NO：15嵌合性A3重鏈(muA3-huIgG1)EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRQWDYDVRAMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
    SEO ID NO：16嵌合性A3 VH EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRQWDYDVRAMNYWGQGTLVTVSS
    SEQ ID NO：17嵌合性A3 VH-CDR1 TYAMN
    SEQ ID NO：18嵌合性A3 VH-CDR2 RIRSKSNNYATYYADSVKD
    SEQ ID NO：19嵌合性A3 VH-CDR3 QWDYDVRAMNY
    SEQ ID NO：20嵌合性A3輕鏈(muA3-huKappa)DIVMTQSHIFMSTSVGDRVSITCKASQDVDTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRLTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    SEQ ID NO：21嵌合性A3 VL DIVMTQSHIFMSTSVGDRVSITCKASQDVDTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRLTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGQGTKLEIK
    SEQ ID NO：22嵌合性A3 VL-CDR1 KASQDVDTAVA
    SEQ ID NO：23嵌合性A3 VL-CDR2 WASTRLT
    SEQ ID NO：24嵌合性A3 VL-CDR3 QQYSSYPYT
    SEO ID NO：25人化A3人IgG1重鏈：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRQWDYDVRAMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
    SEQ ID NO：26人化A3 VH：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCVRQWDYDVRAMNYWGQGTLVTVSS
    SEQ ID NO：27人化A3 VH-CDR1：TYAMN
    SEQ ID NO：28人化A3 VH-CDR2：RIRSKSNNYATYYADSVKD
    SEQ ID NO：29人化A3 VH-CDR3：QWDYDVRAMNY
    SEQ ID NO：30人化A3人Kappa輕鏈：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRLTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    SEQ ID NO：31人化A3 VL：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRLTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPYTFGQGTKLEIK
    SEQ ID NO：32人化A3 VL-CDR1：KASQDVDTAVA
    SEQ ID NO：33人化A3 VL-CDR2：WASTRLT
    SEQ ID NO：34人化A3 VL-CDR3：QQYSSYPYT
    <110> 惠氏有限責任公司(Wyeth LLC)
    <120> 抗體-藥物共軛體
    <140> TW 101110867
    <141> 2012-03-28
    <150> US 61/470,576
    <151> 2011-04-01
    <150> US 61/593,549
    <151> 2012-02-01
    <150> US 61/602,349
    <151> 2012-02-23
    <160> 34
    <170> PatentIn版本3.5
    <210> 1
    <211> 449
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A1人IgG1重鏈
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 214
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A1人Kappa輕鏈
    <400> 2
    <210> 3
    <211> 119
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-VH
    <400> 3
    <210> 4
    <211> 107
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-VL
    <400> 4
    <210> 5
    <211> 5
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-HC CDR1
    <400> 5
    <210> 6
    <211> 17
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-HC CDR2
    <400> 6
    <210> 7
    <211> 10
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 人工序列A1-HC CDR3
    <400> 7
    <210> 8
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-LC-CDR1
    <400> 8
    <210> 9
    <211> 7
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-LC-CDR2
    <400> 9
    <210> 10
    <211> 9
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-LC-CDR3
    <400> 10
    <210> 11
    <211> 420
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人5T4抗原
    <400> 11
    <210> 12
    <211> 446
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A1人IgG4m重鏈
    <400> 12
    <210> 13
    <211> 119
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人IgG4m VH(A1-IGG4-VH)
    <400> 13
    <210> 14
    <211> 5
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列A1-IgG4-VH-CDR1
    <400> 14
    <210> 15
    <211> 452
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3重鏈(muA3-huIgG1)
    <400> 15
    <210> 16
    <211> 122
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VH
    <400> 16
    <210> 17
    <211> 5
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VH-CDR1
    <400> 17
    <210> 18
    <211> 19
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VH-CDR2
    <400> 18
    <210> 19
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VH-CDR3
    <400> 19
    <210> 20
    <211> 214
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3輕鏈(muA3-huKappa)
    <400> 20
    <210> 21
    <211> 107
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VL
    <400> 21
    <210> 22
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VL-CDR1
    <400> 22
    <210> 23
    <211> 7
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VL-CDR2
    <400> 23
    <210> 24
    <211> 9
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列嵌合性A3 VL-CDR3
    <400> 24
    <210> 25
    <211> 452
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3人IgG1重鏈
    <400> 25
    <210> 26
    <211> 122
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VH
    <400> 26
    <210> 27
    <211> 5
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VH-CDR1
    <400> 27
    <210> 28
    <211> 19
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VH-CDR2
    <400> 28
    <210> 29
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VH-CDR3
    <400> 29
    <210> 30
    <211> 214
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3人Kappa輕鏈
    <400> 30
    <210> 31
    <211> 107
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VL
    <400> 31
    <210> 32
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VL-CDR1
    <400> 32
    <210> 33
    <211> 7
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VL-CDR2
    <400> 33
    <210> 34
    <211> 9
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 合成序列人化A3 VL-CDR3
    <400> 34
    权利要求:
    Claims (19)
    [1] 一種下式之抗體-藥物共軛體：Ab-(LU-D)p或彼之醫藥上可接受之鹽，其中(a)Ab係抗5T4抗體或彼之抗原結合部位，該抗體或彼之抗原結合部位包含具有下列之重鏈可變區：(i)如SEQ ID NO：5所示之VH CDR1區，(ii)如SEQ ID NO：6所示之VH CDR2區，及(iii)如SEQ ID NO：7所示之VH CDR3區，(b)LU係選自順丁烯二醯亞胺基己醯基(maleimidocaproyl)或順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸(Val)-瓜胺酸(Cit)之連接子單位，(c)p係自約1至約8之整數，且(d)D係選自MMAE、MMAD或MMAF之藥物單位。
    [2] 如申請專利範圍第1項之抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位包含具有下列之輕鏈可變區：(a)如SEQ ID NO：8所示之VL CDR1區，(b)如SEQ ID NO：9所示之VL CDR2區，及(c)如SEQ ID NO：10所示之VL CDR3區。
    [3] 如申請專利範圍第2項之抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位另包含：1)重鏈可變區，該重鏈可變區具有：(a)如SEQ ID NO：5所示之VH CDR1區，(b)如SEQ ID NO：6所示之VH CDR2區，及(c)如SEQ ID NO：7所示之VH CDR3區，2)輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有：(a)如SEQ ID NO：8所示之VL CDR1區，(b)如SEQ ID NO：9所示之VL CDR2區，及(c)如SEQ ID NO：10所示之VL CDR3區。
    [4] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位包含SEQ ID NO：3之VH區及SEQ ID NO：4之VL區。
    [5] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中該抗5T4抗體或彼之抗原結合部位係由具有SEQ ID NO：1之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成。
    [6] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中該抗體或彼之抗原結合部位辨識人5T4抗原上之表位，其中該表位包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的胺基酸殘基173至258及282至361。
    [7] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中該LU係順丁烯二醯亞胺基己醯基。
    [8] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中該藥物係MMAF。
    [9] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其中p係自約1至約4之整數。
    [10] 如申請專利範圍第1項之抗體-藥物共軛體，其中：(a)該抗5T4抗體係由具有SEQ ID NO：1之重鏈及具有SEQ ID NO：2之輕鏈組成，(b)該LU係順丁烯二醯亞胺基己醯基，(c)該藥物係MMAF，且(d)p係4。
    [11] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體-藥物共軛體，其係用於治療5T4陽性癌。
    [12] 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體-藥物共軛體及醫藥上可接受之載劑。
    [13] 一種如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體-藥物共軛體於製造供治療病患之5T4陽性癌的藥物之用途。
    [14] 如申請專利範圍第13項之用途，其中該癌係選自結直腸癌、乳癌、胰癌或非小細胞肺癌。
    [15] 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之抗5T4抗體。
    [16] 一種載體，其包含如申請專利範圍第15項之核酸。
    [17] 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第16項之載體。
    [18] 一種用於產製抗體之方法，其包含培養如申請專利範圍第17項之宿主細胞及自該培養回收該抗體。
    [19] 一種用於產製抗5T4抗體-藥物共軛體之方法，該方法包含：(a)化學連接選自順丁烯二醯亞胺基己醯基或順丁烯二醯亞胺基己醯基-Val-Cit之連接子單位與選自MMAE、MMAD或MMAF之藥物單位，(b)使該連接子-藥物與自如申請專利範圍第18項之細胞培養所回收之抗體共軛，及(c)純化該抗體-藥物共軛體。
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